荧光定量PCR 技术服务

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。随着分子生物学技术研究的不断进展,定量PCR技术取得了突飞猛进的发展,实时定量PCR (real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术。所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量。

主要实验步骤如下:

1. 设计并合成Realtime PCR引物。
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR® Green)的PCR反应的优化。
3. 客户样品RNA抽提
实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),匀浆后抽提RNA。
实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,PBS清洗细胞,去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA
4. RNA质量检测
a. 紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度
b. 使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。
5. 使用逆转录酶(Promega)进行反应,将样品RNA逆转录为cDNA。
6. 制备标准曲线样品:
进行相对定量,需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增,其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7. 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中(其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司),进行RealTime PCR扩增和检测。
8. 检测结果进行标准曲线分析:以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差,所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9. 提供实验报告:包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表

实时定量PCR全套技术服务收费标准
☆实验步骤
1至9个标本10个标本以上
组织或细胞RNA抽提
RNA质量检测
cDNA制备  300元(一个组织或细胞标本) 270元(一个组织或细胞标本)
目的基因实时定量PCR
看家基因实时定量PCR
标准曲线制备
数据分析   200元(一个标本一个指标)
标准曲线制备及看家基因内参免费 180元(一个标本一个指标)
标准曲线制备及看家基因内参免费 

☆全套技术服务
您只需提供组织或细胞标本,我们为您完成RNA抽提,cDNA制备,实时定量PCR,标准曲线制备及数据分析的所有步骤。
标本的运输费用及引物合成费用客户自理
如需制作PCR电泳效果图,每张(1至9个标本一张)收取100元

 

分子生物学 服务

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